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抗體陣列的多重蛋白質(zhì)檢測(cè)

更新時(shí)間:2023-08-01      點(diǎn)擊次數(shù):1835

微陣列是一種能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分子(例如核酸、肽、蛋白質(zhì)或抗體)的測(cè)定方法。它們被稱為“微"陣列,因?yàn)榉治鑫锸窃诤苄〉谋砻娣e內(nèi)測(cè)量的;例如,可以在標(biāo)準(zhǔn)載玻片(75 毫米 x 25 毫米)上分析數(shù)千個(gè)分子。這些工具在研究和臨床中具有無價(jià)的價(jià)值,因?yàn)檫@些數(shù)據(jù)代表了某一時(shí)間點(diǎn)發(fā)生的生物過程的大快照。用于測(cè)量蛋白質(zhì)的一種微陣列是抗體陣列。與一次僅分析一種蛋白質(zhì)的“單重"測(cè)定(例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)相比,抗體陣列提供了一種更實(shí)惠且更具成本效益的替代方案,且樣品量要求(ELISA)。

抗體陣列的工作原理

抗體陣列將捕獲抗體固定到固體基質(zhì)上,例如載玻片、膜或微珠。對(duì)于平面陣列,具有已知結(jié)合特異性的不同捕獲抗體以可尋址格式點(diǎn)樣到標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片或硝酸纖維素膜上(圖 1A)。對(duì)于基于珠子的陣列,捕獲抗體被固定到具有不同尺寸和熒光特性的不同珠子上。由于每種特異性抗體都固定在具有特征的珠子上,因此每個(gè)珠子的蛋白質(zhì)靶標(biāo)是已知的。

圖 1. 陣列基底和信號(hào)檢測(cè)。 (A)為了生產(chǎn)抗體陣列,捕獲抗體以可尋址的形式固定在玻璃、膜或微珠上。不同的顏色表示不同的目標(biāo)蛋白。(B)使用熒光或化學(xué)發(fā)光進(jìn)行多重蛋白質(zhì)檢測(cè)。


圖 2.基于標(biāo)記的免疫測(cè)定法和基于夾心的免疫測(cè)定法的比較。 (A)捕獲抗體與生物素化蛋白質(zhì)結(jié)合。(B)目標(biāo)蛋白夾在捕獲抗體和生物素化檢測(cè)抗體之間。(C)蛋白質(zhì)上的目標(biāo)聚糖部分夾在捕獲抗體和生物素化凝集素之間。


定性、半定量和定量數(shù)據(jù)

抗體陣列可以生成用于多重蛋白質(zhì)檢測(cè)的定性、半定量或定量數(shù)據(jù)(圖 3)。定性數(shù)據(jù)的一個(gè)例子是僅通過肉眼評(píng)估的蛋白質(zhì)印跡條帶的強(qiáng)度。然而,通過定性評(píng)估很難準(zhǔn)確估計(jì)光斑強(qiáng)度;因此,半定量和定量數(shù)據(jù)是優(yōu)選的。

半定量和定量數(shù)據(jù)具有一定值的熒光或化學(xué)發(fā)光輸出;例如,像素強(qiáng)度。半定量和定量數(shù)據(jù)之間的主要區(qū)別在于,定量數(shù)據(jù)具有可以與樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行比較的標(biāo)準(zhǔn)曲線。可以通過半定量數(shù)據(jù)獲得樣品之間的相對(duì)表達(dá)差異(即倍數(shù)變化)。通過定量數(shù)據(jù)獲得精確的蛋白質(zhì)濃度。

用于多重蛋白質(zhì)檢測(cè)的陣列生成的數(shù)據(jù)輸出類型
圖 3. 從蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)示例中獲得的定性、半定量和定量數(shù)據(jù)的比較。


數(shù)量要求

分析所需的樣品量取決于樣品稀釋度、基質(zhì)(即膜、玻璃、珠子)和設(shè)計(jì)原理(即基于標(biāo)簽、基于夾心)。

樣品稀釋

樣品應(yīng)至少稀釋 2 倍,以避免出現(xiàn)稱為“樣品基質(zhì)效應(yīng)"(SME) 的現(xiàn)象,這是非線性稀釋響應(yīng)和不準(zhǔn)確數(shù)據(jù)的常見原因。當(dāng)樣品中的蛋白質(zhì)或其他成分影響抗體與其靶分子結(jié)合的能力時(shí),就會(huì)發(fā)生這種情況。例如,蛋白質(zhì)可能與目標(biāo)分子結(jié)合,從而阻斷抗體的結(jié)合位點(diǎn)(圖 4A)。中小企業(yè)是已知和未知原因的結(jié)果。然而,通過適當(dāng)?shù)臉悠废♂專|(zhì)效應(yīng)可以忽略不計(jì)(圖 4B)。最佳稀釋度會(huì)根據(jù)樣品類型、實(shí)驗(yàn)和目標(biāo)分子而有所不同;因此,在運(yùn)行整個(gè)實(shí)驗(yàn)之前,用一些樣品優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件非常重要。一種可能不需要稀釋的樣品類型是尿液,因?yàn)樗牡鞍踪|(zhì)含量非常低。

對(duì)于血清和血漿以外的樣品,樣品稀釋前的原始總蛋白濃度應(yīng)至少為 1 mg/ml。然而,建議總蛋白濃度高于 2 mg/ml 以改善信號(hào)。這些濃度不包括可與條件培養(yǎng)基樣品一起使用的任何血清(例如胎牛血清)。重要的是,使用濃度低于 1 mg/ml 的條件培養(yǎng)基樣品仍可實(shí)現(xiàn)陣列上的高信噪比,因?yàn)樯锨逡旱牡鞍踪|(zhì)含量低于細(xì)胞和組織。個(gè)體之間血清和血漿中的蛋白質(zhì)濃度范圍很窄,平均總蛋白質(zhì)濃度約為 70 mg/ml。

不同的細(xì)胞和組織含有不同量的蛋白質(zhì)。因此,加載到陣列上的細(xì)胞、組織和樣品的量必須憑經(jīng)驗(yàn)確定。盡管如此,良好的起點(diǎn)是:每 100 萬個(gè)細(xì)胞或 10 mg 組織使用 500 µL 裂解緩沖液,在 100 mm 組織培養(yǎng)板中接種約 100 萬個(gè)細(xì)胞,并培養(yǎng) 5 天作為培養(yǎng)基樣品。

請(qǐng)參閱我們的其他博客,了解有關(guān)制備用于免疫測(cè)定的細(xì)胞和組織裂解物條件培養(yǎng)基樣品血清/血漿樣品尿液的更多信息。

基板及設(shè)計(jì)原理

由于膜陣列的表面積較大,因此比玻璃陣列和珠陣列需要更多的樣品。然而,基于膜的陣列仍然是多重蛋白質(zhì)檢測(cè)的流行選擇,因?yàn)樗鼈円子诓僮鳎梢允褂贸R娗伊畠r(jià)的儀器檢測(cè)其化學(xué)發(fā)光,并且它們的背景噪聲通常低于細(xì)胞和組織的玻璃基陣列裂解物。

利用基于標(biāo)記的陣列,每種樣品蛋白質(zhì)都可以與大量生物素分子結(jié)合,從而放大信號(hào)并提高靈敏度。因此,基于標(biāo)簽的陣列需要非常低的樣本量。表 1 提供了基于陣列基質(zhì)和設(shè)計(jì)原理的血清樣品體積要求的比較。列出的體積未考慮移液誤差或管側(cè)面的樣品損失。

樣品基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對(duì)多重蛋白質(zhì)檢測(cè)產(chǎn)生負(fù)面影響
圖 4. 樣品基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致非線性稀釋響應(yīng)。 (A) SME 示例,其中當(dāng)總蛋白濃度較高時(shí),蛋白質(zhì)(黃色)與目標(biāo)分子(綠色)結(jié)合,從而阻止檢測(cè)抗體結(jié)合。(B)稀釋實(shí)驗(yàn)示例,其中當(dāng)樣品稀釋至少 64 倍時(shí),SME 變得可以忽略不計(jì)。

表 1. 基于固體支持物的血清體積要求和抗體陣列的設(shè)計(jì)原理

* 血清樣品的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。

基于標(biāo)簽的抗體陣列與Sandwich-based的抗體陣列

基于標(biāo)簽的數(shù)組

基于標(biāo)記的抗體陣列每種蛋白質(zhì)僅使用一種抗體:捕獲抗體(圖 2A)。因此,由于有大量可用抗體,非常高密度的陣列是可能的。由于抗體可以與非靶蛋白發(fā)生交叉反應(yīng),因此使用基于標(biāo)記的陣列獲得的任何結(jié)果都應(yīng)使用正交平臺(tái)(例如蛋白質(zhì)印跡)進(jìn)行驗(yàn)證。 RayBiotech 提供用于多重蛋白質(zhì)檢測(cè)的高密度標(biāo)記陣列(L 系列),可測(cè)量多達(dá) 6,000 種人類蛋白質(zhì);第1308章 鼠類蛋白; 1500 種大鼠蛋白;或同時(shí) 500 個(gè)兔蛋白 。

基于標(biāo)簽的數(shù)組摘要
  • 最高密度

  • 特異性低于夾心陣列

  • 所需樣品量非常低

  • 半定量數(shù)據(jù)

  • 固體支撐:玻璃和膜

  • 生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的選擇

 Sandwich-based的陣列

基于三明治的陣列具有非常高的特異性,因?yàn)?/span>每種蛋白質(zhì)需要兩種不同的抗體才能檢測(cè)到固定化蛋白質(zhì)(圖 2B)。然而,找到可以在夾心免疫測(cè)定中配對(duì)的兩種抗體可能需要進(jìn)行廣泛的抗體篩選。抗體不僅必須與同一蛋白質(zhì)上的不同區(qū)域(或表位)結(jié)合,而且表位必須易于在平臺(tái)上結(jié)合。在某些情況下,兩種抗體可能不會(huì)作為捕獲-檢測(cè)對(duì)工作,而是以檢測(cè)-捕獲配置工作。

RayBiotech 提供基于膜(C 系列)、珠子(RayPlex)和玻璃(G 系列磷酸化陣列Quantibody)基質(zhì)的夾心陣列。這些陣列可以測(cè)量多達(dá)1,200 種人類蛋白質(zhì); 640 種小鼠蛋白質(zhì);或同時(shí) 67 種大鼠蛋白。使用這些陣列檢測(cè)到的其他物種包括牛、犬、貓、馬、豬、兔、恒河猴、雞、海豚和綿羊。 RayPlex 和 Quantibody 陣列都提供定量數(shù)據(jù)。

 Sandwich-based的陣列總結(jié)
  • 低密度到高密度

  • 最高特異性:每個(gè)靶標(biāo)有兩種抗體(即抗體對(duì))

  • 半定量和定量數(shù)據(jù)

  • 固體支持物:玻璃、膜和珠子

  • 臨床試驗(yàn)和生物標(biāo)志物驗(yàn)證的選擇

表 2 提供了 RayBiotech 提供的基于標(biāo)記的抗體陣列和基于夾心的陣列的比較。圖 5 描繪了幫助在多重蛋白質(zhì)檢測(cè)的定性、半定量或定量數(shù)據(jù)之間做出決定的決策樹。


表 2. 基于標(biāo)簽和 Sandwich-based的抗體陣列的比較

用于多重蛋白質(zhì)檢測(cè)的抗體陣列的比較
數(shù)組決策樹
圖 5. 幫助選擇適合實(shí)驗(yàn)的抗體陣列的決策樹。 * = 對(duì)所有需要 RayBiotech(美國佐治亞州)提供的兼容激光掃描儀的玻璃基陣列進(jìn)行免費(fèi)掃描和數(shù)據(jù)提取。還提供完整的測(cè)試服務(wù),包括樣品處理、掃描、數(shù)據(jù)提取和數(shù)據(jù)分析。


結(jié)論

抗體陣列是一種用于蛋白質(zhì)分析和多重蛋白質(zhì)檢測(cè)的強(qiáng)大技術(shù)。抗體芯片具有不同類型的格式和數(shù)據(jù)輸出,可以滿足不同的研究需求和能力。可同時(shí)分析數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì)的高密度陣列是大規(guī)模蛋白質(zhì)分析和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)研究的理想選擇。還有一些較小的小組專注于特定的生物過程或途徑,例如炎癥、生長因子、血管生成和肥胖。值得注意的是,抗體陣列的面板可以定制,并且可以為人員、時(shí)間或儀器有限的實(shí)驗(yàn)室提供完整的測(cè)試服務(wù)



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