選擇您的關(guān)鍵試劑

固相：應(yīng)選擇專門允許結(jié)合檢測(cè)中的抗原或抗體成分的固相以避免背景噪音。可用固相的例子有微孔板（通常是聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯）、小管和珠子。小管和珠子通過提供較低的檢測(cè)限來擴(kuò)展測(cè)定參數(shù)。這是因?yàn)樗鼈冊(cè)试S靈活的測(cè)試數(shù)量和測(cè)定體積，同時(shí)還為涂層和反應(yīng)的發(fā)生提供更大的表面積。珠子的使用可以進(jìn)一步減少孵育時(shí)間，并使 ELISA 能夠用于不同的微流體系統(tǒng)，即自動(dòng)化臺(tái)式 ELISA。珠子本身可以是磁性的，因此使用磁鐵可以輕松地將其分布在整個(gè)液相中。

樣本：

應(yīng)選擇具有已知分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，以涵蓋從檢測(cè)下限到上限（校準(zhǔn)）的整個(gè)測(cè)定范圍。這是為了確保無論樣品中可測(cè)量的分析物濃度較低還是較高，測(cè)定的靈敏度和精確度都是一致的。此外，患者樣本應(yīng)取自并包含各種年齡范圍、種族、性別和健康狀況，以確保檢測(cè)的廣泛適用性和可靠的結(jié)果。在定量之前和定量過程中保持目標(biāo)分析物穩(wěn)定對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定濃度至關(guān)重要。因此，樣品提取、制備和儲(chǔ)存中涉及的以下分析前條件尤其重要。

• 必須選擇能夠保持分析物穩(wěn)定性的適當(dāng)樣品基質(zhì)。

• 可能需要將蛋白酶抑制劑添加到生物流體樣品基質(zhì)中，以防止天然存在的蛋白酶降解分析物。

• 收集患者樣本時(shí)，必須評(píng)估運(yùn)動(dòng)、禁食、酒精、煙草和季節(jié)變化的影響。

• 必須確定最佳樣品儲(chǔ)存溫度（-80° C、-20° C、2-8° C 或室溫）和凍融循環(huán)次數(shù)

• 必須研究樣品在室溫下放置并在檢測(cè)環(huán)境中保持穩(wěn)定的時(shí)間長(zhǎng)度。 

• 移液前必須以標(biāo)準(zhǔn)化方式充分混合或倒置樣品，以確保分析物在整個(gè)樣品基質(zhì)中均勻分布。

洗滌緩沖液

洗滌緩沖液的目的是洗掉任何未結(jié)合或過量的物質(zhì)，否則可能會(huì)產(chǎn)生背景噪音信號(hào)并干擾測(cè)定和結(jié)果。洗滌緩沖液的設(shè)計(jì)具有與生理?xiàng)l件相似的 pH 值和鹽濃度，并含有TRIS ( FT15751 )、PBS 和聚山梨酯等洗滌劑。如果檢測(cè)到大量“背景噪音"而不是信號(hào)強(qiáng)度，則增加洗滌緩沖液的體積、洗滌劑的濃度或/和洗滌步驟的數(shù)量通常會(huì)有所幫助。這將增加所有未結(jié)合材料被去除的可能性。如果懷疑分析物降解或者分析物在程序中被洗掉，則減少洗滌步驟數(shù)、洗滌緩沖液體積或緩沖液中去污劑的濃度可能是有益的。

封閉緩沖液

為了防止與其他檢測(cè)成分發(fā)生交叉反應(yīng)和非特異性抗原結(jié)合，需要使用封閉劑。通常將牛奶溶液（脫脂奶粉）、全血清或牛血清白蛋白 (BSA) ( PRO-422 ) 等試劑添加到緩沖液中，并在第一次洗滌步驟后使用，以飽和孔的自由表面。

這種封閉緩沖液也可以含有去污劑，但應(yīng)避免使用可能干擾測(cè)定的生物素或免疫球蛋白等成分。總體封閉緩沖液可以獲得更高的信噪比，并且可以在使用的封閉劑的體積、濃度和類型方面進(jìn)行優(yōu)化。

酶和底物（信號(hào)系統(tǒng)）

常用的信號(hào)系統(tǒng)之一是酶聯(lián)抗體，并且有多種不同形式和物種類型可供選擇。常用于 ELISA，其中堿性磷酸酶和磷酸對(duì)硝基苯酯底物在目標(biāo)分析物存在的情況下會(huì)產(chǎn)生黃色。檢測(cè)抗體還可以與過氧化物酶并與氨基水楊酸和鄰苯二胺底物一起使用，如果出現(xiàn)陽性結(jié)果，它們會(huì)呈現(xiàn)棕色。總體酶反應(yīng)用于證明反應(yīng)的特異性和速率。信號(hào)出現(xiàn)后，可以添加氫氧化鈉、鹽酸或硫酸來終止反應(yīng)。 

在測(cè)定開發(fā)過程中，性能和財(cái)務(wù)方面在確定應(yīng)使用哪些試劑以及濃度時(shí)起著關(guān)鍵作用。雖然使用較低濃度的酶聯(lián)抗體可能更具成本效益，但可能有必要增加濃度以確保產(chǎn)生足夠的信號(hào)強(qiáng)度。如果您的 ELISA 靈敏度較差，可以通過改變抗體類型（從單克隆抗體到多克隆抗體）或采用不同的信號(hào)系統(tǒng)來放大信號(hào)。第一個(gè)例子是二抗被生物素化，然后添加鏈霉親和素-HRP。由于四個(gè)鏈霉親和素分子可以與生物素相互作用，因此通過添加更多的鏈霉親和素分子進(jìn)行檢測(cè)，可以提高檢測(cè)少量分析物的能力。此外，通過用多種酶、銀納米顆粒標(biāo)記檢測(cè)抗體或使用化學(xué)發(fā)光或熒光底物等替代底物類型，可以提高靈敏度。 

校準(zhǔn)和控制

標(biāo)準(zhǔn)曲線或校準(zhǔn)曲線由分布在測(cè)定范圍內(nèi)的已知分析物濃度的樣品組成。它們?cè)?ELISA 中用作輔助，以便稍后計(jì)算目標(biāo)分子的濃度。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，校準(zhǔn)品和對(duì)照品的矩陣應(yīng)盡可能與所運(yùn)行的天然樣品的矩陣相似。

運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線很有用，如果生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線較差，可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果無效或突出檢測(cè)中的錯(cuò)誤。不正確的抗體結(jié)合或分析物捕獲可能是標(biāo)準(zhǔn)曲線不良的原因。除了校準(zhǔn)曲線外，還應(yīng)使用陽性和陰性對(duì)照樣品。陰性對(duì)照不應(yīng)包含任何感興趣分析物的痕跡，因?yàn)樗鼈冇糜跈z查假陽性和非特異性結(jié)合。陽性對(duì)照應(yīng)含有已知濃度的目標(biāo)分析物。如果測(cè)定檢測(cè)到陽性對(duì)照中存在分析物并且陰性對(duì)照均為陰性，則測(cè)定工作可靠且結(jié)果有效。

使用已知濃度的校準(zhǔn)品創(chuàng)建的 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線示例，X 表明通過曲線插值獲得的未知樣品的濃度。

培養(yǎng)箱和混合器

嘗試并使用 ELISA 的特定孵育時(shí)間和溫度，有助于在捕獲抗體和目標(biāo)分析物之間達(dá)到結(jié)合平衡。控制板周圍溫度的一種方法是使用確保波動(dòng)最小的培養(yǎng)箱。此外，使用混合器可以幫助您的 ELISA 達(dá)到最佳性能，因?yàn)樗兄趯⒃噭┓植荚谡麄€(gè)基質(zhì)中，以促進(jìn)更多的結(jié)合。一般來說，較長(zhǎng)的潛伏期可能有利于靈敏度，因?yàn)橛懈嗟臅r(shí)間進(jìn)行結(jié)合。然而，還應(yīng)該測(cè)試縮短的孵育時(shí)間。

捕獲抗體的固定化方法

當(dāng)捕獲抗體固定到 ELISA 板上時(shí)，其方向可能會(huì)發(fā)生變化，從而降低其親和力以及與抗原結(jié)合的機(jī)會(huì)。此外，洗滌步驟中抗體的置換可能導(dǎo)致靈敏度和重現(xiàn)性較差。解決這個(gè)問題的一種方法是使用單層表面，使抗體能夠共價(jià)結(jié)合到板上，但 Tania García-Maceira 等人已經(jīng)證明了靈敏度的更大改進(jìn)。 （2020）通過使用甲殼素涂層的聚苯乙烯表面來實(shí)現(xiàn)。使用這種固定形式，抗體通過與幾丁質(zhì)結(jié)合域融合，以更好的方向被捕獲到微量滴定板上。