Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒

NEB Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒經(jīng)過優(yōu)化，適用于水解探針法的目標 RNA 序列實時定量。一步法 RT-qPCR 為 RNA 檢測和定量提供了一種便捷、強大的方法。在同一管中，RNA 首先由反轉錄酶轉化為 cDNA，然后使用 DNA 依賴型 DNA 聚合酶擴增 cDNA，從而可以進行 qPCR 定量。探針法 qPCR/RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5′→3′ 核酸外切酶活性，將淬滅的目標特異性探針切斷發(fā)出熒光，并實時監(jiān)測熒光值的增加，以測量每個循環(huán)中的 DNA 擴增。在熒光信號顯著超過背景熒光的位置，可以確定循環(huán)數(shù)或 Cq 值。Cq 值可用于評估兩個或多個樣品的靶基因相對豐度，通過已知稀釋濃度樣品的標準曲線，可對靶基因進行絕對定量。

在 Luna 通用一步法探針 RT-qPCR 試劑盒中，聯(lián)合使用熱啟動 Taq DNA 聚合酶與新型 WarmStart 反轉錄酶，通過適配體可逆抑制來雙重控制酶活性。這種溫控活化機制可避免熱循環(huán)前的非特異擴增，從而讓室溫建立體系更安全。經(jīng)改造的 Luna WarmStart 反轉錄酶的熱穩(wěn)定性比許多反轉錄酶更高，其最佳反應溫度為 55℃。對于困難靶標/模板，最多可將反轉錄步驟的溫度升至 60℃，不會影響 Luna 性能。

注意：為確保 Luna WarmStart 反轉錄酶全激活，建議溫育溫度不低于 50℃。

Luna 通用探針一步法反應混合液濃度為 2X，包含熱啟動 Taq DNA 聚合酶、dNTP 和所有必需的緩沖液成分。該預混液包含惰性參比染料，可與多種 qPCR 儀器兼容，包括需要高 ROX 或低 ROX 參比信號的儀器。特色的是：預混液還包含可防止交叉污染的 dUTP，以及有助于觀察反應體系建立的非熒光可見示蹤染料。該示蹤染料與 qPCR 常用熒光團的光譜沒有重疊，因此不會干擾實時檢測。

Luna WarmStart 反轉錄酶預混液的濃度為 20X，其中包含 Luna WarmStart 反轉錄酶以及用于防止 RNA 降解的小鼠 RNase 抑制劑（詳情請見產(chǎn)品手冊中的模板制備）。適用于各種 RNA 樣品類型（總 RNA、poly（A）-RNA 等）和來源。

.圖 1：NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒具有更高的靈敏度、更出眾的可重復性以及更優(yōu)異的 RT-qPCR 表現(xiàn)

使用 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒，執(zhí)行了人 GAPDH 基因的 RT-qPCR 靶標檢測，起始量模板為 8 個 10 倍梯度稀釋的 Jurkat 總 RNA（1 μg – 0.1 pg），每個濃度的樣品做 8 個重復。實驗按照試劑盒建議的操作流程進行，反應中包含一個 55℃ 溫育 10 分鐘的反轉錄步驟，以便于具有熱穩(wěn)定性的 Luna WarmStart 反轉錄酶發(fā)揮作用。

圖 2：NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒在多重檢測中展現(xiàn)強大功效

使用 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒，執(zhí)行了人 GAPDH 基因、核糖體蛋白 L32g 和 PI3 激酶相關的激酶 SMG1 基因的多重 RT-qPCR 靶標檢測。起始量模板濃度為 7 個 10 倍稀釋的 Jurkat 總 RNA（1 μg – 1 pg），每個濃度的樣品做 4 個重復。擴增圖表如上所示，左邊是疊加的結果，右邊是每個基因單獨的檢測結果。若要解釋拷貝數(shù)的差異，低拷貝的模板（SMG1）使用的引物濃度為 0.4 µM，高拷貝的模板（L32g 和 GAPDH）使用的引物濃度為 0.2 µM。Luna 產(chǎn)品在多重 RT-qPCR 檢測中展現(xiàn)出高效率、可重復性、靈敏度和性能。

圖 3：通過與市售的探針法 RT-qPCR 試劑相比，Luna 產(chǎn)品展現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性和特異性

使用市售的 RT-qPCR 試劑對 7 個不同豐度、長度和 GC 含量的 RT-qPCR 靶標進行測試。測試均根據(jù)產(chǎn)品說明書進行，數(shù)據(jù)來源于兩位實驗人員。從以下方面評估了反應結果：擴增效率、低起始量檢測能力及無模板擴增值（ΔCq = 無模板對照的平均 Cq – *低起始量的平均 Cq）。此外，還評估了擴增結果的一致性、可重復性和總體曲線質量（質量分數(shù)）。柱狀圖展示了達到可接受的性能標準的目標百分比（由點圖上的綠色框表示，質量分數(shù) > 3）。NEB 和其它供應商的結果如下所示：Quanta，qScript™ XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix®；ABI，TaqMan® RNA-to-Ct 1-Step Kit；QIAGEN，QuantiFast® Probe RT-PCR Kit；Bio-Rad，iTaq™ Universal Probes One-Step Kit；Promega®，GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System。NEB 的 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒性能優(yōu)于其它測試試劑。

• 注意事項

1. 引物設計
   使用 qPCR 引物設計軟件（如 Primer3），可在盡力減少非特異性擴增和引物二聚體的情況下提高擴增成功率。GC/AT 含量平衡（40 – 60%）的靶標，往往具有最高的擴增效率。若可行，盡量多輸入目標周圍區(qū)域序列，以便引物序列設計更加完善，同時使用檢索功能，檢索相關序列數(shù)據(jù)庫（避免潛在的非特異性擴增）。建議在已知的 RNA 剪接位點范圍內(nèi)設計引物，防止基因組 DNA 擴增。

2. 引物和探針濃度
   對大多數(shù)靶標而言，400 nM（每個引物）的終濃度就可以提供最佳性能。如有必要，可以在 100 – 900 nM 范圍內(nèi)優(yōu)化引物濃度。為獲得最佳結果，探針應包括在 200 nM 的范圍內(nèi)。可以在 100 – 500 nM 范圍內(nèi)優(yōu)化探針濃度。

3. 多重檢測
   在確定要納入多重檢測反應中的熒光團時，一定要選擇兼容的熒光發(fā)光基團和熒光吸收基團（例如，所選實時儀器可以容納且熒光光譜重疊度最小）。若為依賴 ROX 的儀器，避免使用 ROX 標記的探針。包含 400 nM 的正向和反向引物，以及反應中要檢測的各靶標的 200 nM 探針。對于豐度差異較大的靶標，推薦對豐度較高的靶標使用較低的引物濃度（如 200 nM）。如有必要，根據(jù)性能調整濃度（引物 100 – 900 nM，探針 100 – 500 nM）。將 qPCR 方案加載到實時儀器上時，一定要選擇適當?shù)墓鈱W通道，因為有些儀器的單通道記錄模式會妨礙多重檢測數(shù)據(jù)的收集和分析。在嘗試進行多重檢測之前，應單獨測試引物和探針組的功能。

4. 擴增子長度
   為確保成功獲得一致的 qPCR 結果，最大限度地提高 PCR 效率非常重要。其中一個重要方面就是設計短片段 PCR 擴增子（通常為 70 – 200 bp）。如果靶標超出范圍，可能需要對實驗進行優(yōu)化。

5. 模板制備及相關濃度
   Luna RT-qPCR 與通過傳統(tǒng)核酸純化方法制備的 RNA 樣品兼容。為保障長效穩(wěn)定性，制備好的 RNA 應儲存在含有 EDTA 的緩沖液中（如 1X TE）；稀釋液應在 qPCR 實驗前采用 TE 或水新鮮制備。注意：RNA 模板質量會對 RT-qPCR 效率產(chǎn)生極大的影響。處理 RNA 時應采取適當?shù)念A防措施，防止 RNase 或 DNase 污染。強烈推薦使用（提供的）無核酶水。若可行，可使用 DNase I 處理 RNA，將殘留基因組 DNA 除去。
   一般來說，標準品和未知樣品的有效濃度范圍應該在 108 拷貝到 10 拷貝之間。注意：根據(jù)泊松分布，對于單拷貝范圍內(nèi)的稀釋液，某些樣品會包含多個拷貝，某些則不含拷貝。對于總 RNA，Luna 一步法試劑盒可以在 8 個濃度梯度的起始量范圍內(nèi)（1 μg – 0.1 pg）提供良好的線性定量能力。對于大多數(shù)靶標，推薦使用 100 ng – 10 pg 的總 RNA 標準起始量范圍。對于經(jīng)純化的 mRNA，推薦起始量 ≤ 100 ng。對于體外轉錄的 RNA，推薦起始量 ≤ 109 拷貝。

6. ROX 參比染料

   對于某些實時儀器，建議使用惰性參比染料（通常是 ROX）來避免儀器限制（例如“邊緣效應"、氣泡、微小體積差異以及反應過程中塵?；蛭⒘５淖园l(fā)熒光）造成的孔與孔之間的反應誤差。不過，對于模板/引物的加樣錯誤、異質混合液和蒸發(fā)/凝結問題造成的誤差，ROX 校正幾乎不起作用。

   以下 Luna® qPCR 產(chǎn)品包含通用惰性參比染料：Luna 通用 qPCR 預混液（NEB #M3003）、Luna 通用探針法 qPCR 預混液（NEB #M3004）、Luna 通用一步法 RT-qPCR 試劑盒（NEB #E3005）和 Luna 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒（NEB #E3006）。這些產(chǎn)品兼容多種儀器（高 ROX、低 ROX、無 ROX），因此無需額外的 ROX 來進行校正。

   Luna 探針一步法 RT-qPCR 試劑盒（無 ROX）（E3007）不含參比染料，與無需使用 ROX 的儀器兼容。如果需要 ROX 校正，可自行添加 ROX。如需詳細信息，請參閱儀器廠商說明書。

7. 防止交叉污染
   RT-qPCR 是一種非常靈敏的方法，在新的 RT-qPCR 測定中，之前擴增反應的產(chǎn)物污染會導致各種問題，例如假陽性結果和靈敏度降低。防止這種“交叉"污染的最好辦法就是嚴格按照實驗程序操作，避免擴增后打開反應容器。不過，為進一步滿足預防污染的要求，Luna qPCR 混合液中包含了 dUTP/dTTP 混合物，從而可在擴增過程中將 dU 結合到 DNA 產(chǎn)物中。用尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）對 qPCR/RT-qPCR 實驗進行預處理，通過切除尿嘧啶堿基來消除之前擴增的含尿嘧啶的產(chǎn)物，從而產(chǎn)生不可擴增的 DNA 產(chǎn)物。使用熱敏 UDG 至關重要，因為需要將 UDG 全滅活，防止其破壞新合成的 qPCR 產(chǎn)物。
   
   為防止交叉污染，應在反應混合液中添加終濃度為 0.025 U/μl 的南極熱敏 UDG（NEB #M0372）。要最大限度地消除污染產(chǎn)物，可在室溫下進行 qPCR 實驗，或在進行初始變性之前在 25℃ 條件下溫育 10 分鐘。

8. 反應體系建立與循環(huán)條件
   Luna 一步法試劑盒具有雙重熱啟動功能，因此無需在冰上建立反應體系或在使用前預熱熱循環(huán)儀。
   如果采用 96 孔板，推薦使用 20 μl 最終反應體積。
   如果采用 384 孔板，推薦使用 10 μl 最終反應體積。
   對儀器循環(huán)條件進行編程時，確保在延伸結束時讀取模板讀數(shù)，并在循環(huán)完成后繪制變性（融化）曲線，以分析產(chǎn)物特異性。
   大部分應用只需 40 個循環(huán)的擴增，但低起始量樣品可能需要 45 個循環(huán)。

上海牧榮生物科技有限公司是一家集成服務商，公司堅持“一站式"服務模式，為客戶全面解決實驗、生產(chǎn)、開發(fā)需求。公司整合國際與國內(nèi)資源，加強網(wǎng)絡建設，提高公司內(nèi)部運作效率，為客戶提供方便、快捷的服務。

實驗試劑的注意事項:

(1)切忌與皮膚直接接觸。

(2)要用潔凈的專用取用試劑，用同一種工具不允許同時連續(xù)取用多種試劑。應取完一種試劑后，將工具洗凈(藥勺要擦干)后，才可取用另一種試劑。

(3)易燃易爆性化學試劑必須存放于專用的危險性試劑倉庫里，并存放在不燃燒材料制作的柜、架上，溫度不宜超過28℃，使用時要穿好必要的防護用具實驗室少量瓶裝可設危險品專柜，按性質分格貯存，同一格內(nèi)不得混放氧化劑等性質的抵觸品，并根據(jù)貯存種類配備相應的滅火設備和自動報警裝置。低沸點極易燃燒試劑宜低溫下貯存(5℃以下，禁用有電火花產(chǎn)生的普通家用電冰箱貯存。

(4)強腐蝕類 存放處要求陰涼通風，并與其他藥品隔離放罟。

(5)強氧化劑試劑是過氧化物或含氧酸及其鹽,在適當條件下會發(fā)生爆炸,并可與有機物、鎂、鋁、鋅粉、硫等易燃固體形成爆炸混合物。(存放處要求陰涼通風，溫度不得超過30℃℃。

(6)放射性類 一般化驗室不可能有放射性物質。化驗操作這類物質需要特殊防護設備和知識以保護人身安全，并防止放射性物質的污染與擴散

Luna® 通用探針一步法 RT-qPCR 試劑盒